多酚多糖植物总RNA提取试剂盒

中文名称：多酚多糖植物总RNA提取试剂盒
英文名称：Total RNA Extraction kit from the plant in which polyphenols and polysaccharides are rich
产品规格：50次
本试剂盒可从植物组织，特别是富含多糖多酚或淀粉的植物组织（如棉花叶片，成熟水稻叶片，拟南芥种子，白松松针，香蕉，枇杷叶片，马铃薯块茎，苹果，梨，西瓜果肉，猕猴桃，月季，烟草，沙棘，百合等）中快速提取总RNA，可同时处理大量不同样品。提取的总RNA纯度高，没有基因组、蛋白和其它杂质的污染，可用于RT-PCR、Real Time RT-PCR、芯片分析、Northern Blot、Dot Blot、PolyA筛选、体外翻译、RNase保护分析和分子克隆等多种下游实验。

产品特点：
·针对性强：专门针对多糖多酚等难提植物样本独特配置，流程更优化，结果有保障。
·高效去除基因组：配有高效DNase I，可在柱上快速去除gDNA。
·简便快捷：仅需1小时即可完成RNA提取实验。
·安全低毒：无需酚和氯仿等毒性有机试剂。

不同植物组织RNA提取预期得率：（以100mg样本为例)

分别取100mg香蕉、西瓜、苹果、梨等果肉，红薯、马铃薯等块茎，棉花、月季、枇杷、水稻等的叶片及白松松针等植物样本，采用本试剂盒提取总RNA。洗脱体积30μl，RNA上样量4～6μl，1%琼脂糖凝胶电泳，6V/cm电泳30min.
实验结果证明本试剂盒对广泛的难提取植物样本有优异的总RNA提取效果。

试剂盒组成：

保存条件：室温（15-25℃)保存。RNase-Free DNase I,缓冲液RDD和RNase-Free ddH2O（管装)置于2-8℃保存；加入β-巯基乙醇的裂解液SL 4℃可放置一个月。

预防RNase污染，应注意以下几方面：
1．经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
2．使用RNase-Free的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3．RNA在本制品中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用RNase-Free的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
4．配制溶液应使用RNase-Free ddH2O。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%（V/V，放置过夜，高压灭菌）。

注意事项：
1．操作前在SL中加入β-巯基乙醇至终浓度5%，如475μl SL中加入25 μl β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的SL 4℃可放置一个月，裂解液SL在储存时可能会形成沉淀，如果有沉淀出现，请加热溶解后使用。
2．植物组织裂解是否充分直接影响到RNA提取的质量和产量，本试剂盒中提供的裂解液SL，适用于大多数植物组织的裂解，但有些植物组织（例如玉米的乳白色胚乳，红豆种子或小麦种子）或丝状真菌，由于次级代谢产物较特殊，异硫*酸胍使样品产生沉淀，导致RNA提取效果不佳的现象，购买试剂盒时请提醒我司业务人员更换另一种裂解液HL，将解决该问题。
3．第一次使用前应在漂洗液RW中加入无水乙醇，加入量请参见瓶上标签。

DNase I储存液的配制：
将DNase I干粉（1500U）溶解在550 μl RNase-Free ddH2O中，轻柔混匀，分装后-20℃贮存（可保存9个月）。
注意：从-20℃融化后的DNase I储存液保存于4℃（可保存6周），不要再次冻存。

RNA提取操作步骤：
以下所有离心步骤均在室温下进行。

1．匀浆处理：
  50-100mg植物叶片或果实果肉在液氮中迅速研磨成粉末，加入500 μl SL（使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），立即涡旋剧烈震荡混匀。
  注意1：对于预期RNA得率小于10μg的植物样本，请使用100mg的起始样本量；对于富含淀粉的样本或成熟叶片，请将裂解液SL用量增加至700 μl。
  注意2：由于植物多样性非常丰富，而且同种植物的不同生长发育阶段和不同组织的RNA含量都不相同，请根据具体实验情况选择合适的植物材料的用量。
2．12000rpm（~13400×g)离心2 min。
3．将上清液转移至过滤柱CS上（过滤柱CS放在收集管中)，12000rpm（~13400×g)离心2 min，小心吸取收集管中的上清至新的RNase-Free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。
4．缓慢加入0.4倍上清体积的无水乙醇，混匀（此时可能会出现沉淀），将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12000rpm（~13400×g)离心15 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
  注意：如果上清液体积有损失，请相应调整乙醇的加量。
5．向吸附柱CR3中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)离心15 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
6．DNase I工作液的配制：取10 μl DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70 μl RDD溶液，轻柔混匀。
7．向吸附柱CR3中央加入80 μl的DNase I工作液，室温放置15 min。
8．向吸附柱CR3中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)离心15 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
9．向吸附柱CR3中加入500 μl漂洗液RW （使用前请先检查是否已加入乙醇），12000rpm（~13400×g)离心15 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
10．重复步骤9。
11．12000rpm（~13400×g)离心2 min，将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-50 μl RNase-Free ddH2O，室温放置2 min，12000rpm（~13400×g)离心1 min，得到RNA溶液。
  注意：洗脱缓冲液体积不应少于30 μl，体积过小影响回收效率。RNA样品请在-70℃中保存。如果预期RNA得率大于30 μg，可将步骤11中离心得到的RNA溶液再加入吸附柱CR3中，室温放置2 min，12000rpm（~13400×g)离心1 min，得到RNA溶液。

RNA纯度及浓度检测：
完整性：RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳（电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150V，15 min)检测完整性。由于细胞中70-80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。rRNA大小分别约为5 kb和2 kb，分别相当于28S和18S rRNA；植物叶片中由于含有大量的叶绿体RNA，可见4条或更多rRNA。植物RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
纯度：OD₂₆₀/OD₂₈₀比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD₂₆₀/OD₂₈₀读数在1.8-2.1之间，比值为2.0是高质量RNA的标志。OD₂₆₀/OD₂₈₀读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10mM Tris，pH7.5溶液中测出的OD₂₆₀/OD₂₈₀读数1.8-2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯。
浓度：取一定量的RNA提取物，用RNase-Free ddH2O稀释n倍，用RNase-Free ddH2O将分光光度计调零，取稀释液进行OD₂₆₀,OD₂₈₀测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：
   终浓度（ng/μl）= （OD₂₆₀)×（稀释倍数n)×40 

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！